QUIMERA DE ADN POLIMERASA DEL FAGO φ29

Los experimentos pertenecientes al campo de la biotecnología, llevados a cabo por el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) en relación a la amplificación del ADN le han permitido concluir en la siguiente invención: Quimera de ADN polimerasa del fago φ29.

La ADN polimerasa del fago φ29 presenta varias características de gran interés para la amplificación de ADN como son; una elevada procesividad sin necesidad del concurso de ninguna proteína accesoria y una alta capacidad de desplazamiento de cadena que le permiten replicar el genoma de dicho bacteriófago en un solo evento de unión al ADN, así como una alta fidelidad en la inserción de nucleótidos en la nueva cadena.

Estas características han conducido al desarrollo de una gran variedad de protocolos para la amplificación isotérmica de ADN, basados en el uso de esta polimerasa que permiten la obtención de productos de alta calidad que pueden digerirse o ser secuenciados directamente sin necesidad de purificación previa. Sin embargo, existe una necesidad de protocolos que permitan la amplificación de ADN a partir de cantidades menores del mismo.

Los experimentos realizados responden a esta necesidad mediante dos enfoques:

1) Desarrollo de una composición que mejora significativamente la especificidad y el rendimiento de la reacción.

2) Formación de quimeras entre la ADN polimerasa de φ29 y motivos que unen ADN de manera no específica que aumentan la capacidad de unión al ADN de la enzima.

Con estos experimentos se muestra que la adición simultánea de monolaurato de sorbitán polioxietilenado (Tween® 20) y una sal de amonio al tampón usado habitualmente para la amplificación con la ADN polimerasa de φ29, por un lado, evita la amplificación inespecífica de ADN y, por otro, permite la amplificación detectable y específica a partir de cantidades límite de 0,1 femtogramos (fg) de ADN plasmídico y 10 fg de ADN genómico como molde.

Respecto al aumento de la capacidad de unión al ADN, en la presente invención se han fusionado motivos HhH de la topoisomerasa V de Methanopyrus kandleri al extremo carboxilo de la ADN polimerasa de φ29 a través de una secuencia conectora o linker, originando 4 quimeras diferentes. Estas quimeras son capaces de amplificar el ADN molde a partir de una cantidad menor que la requerida por la ADN polimerasa de φ29 natural.

• Un primer aspecto de la presente invención, se refiere a una quimera de ADN polimerasa que comprende:

a) una secuencia aminoacídica que codifica para una ADN polimerasa del tipo φ29, unida por su extremo Cterminal a

b) una secuencia aminoacídica conectora, unida por su extremo C-terminal a

c) una secuencia aminoacídica que comprende, al menos, un dominio hélice-gancho-hélice (HhH).

• Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de replicación, amplificación o secuenciación de un

ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprende, al menos:

a) la quimera de ADN polimerasa de la invención,

b) un tampón,

c) cloruro magnésico,

d) un cebador, y

e) nucleósidos trifosfato.

FUENTE | OEPM

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