DETECCION DEL VIRUS DE LA NECROSIS PANCREATICA INFECCIOSA EN PECES

Los experimentos llevados a cabo por la Universidad de Málaga en el campo de la acuicultura, han culminado con la siguiente invención: Procedimiento, conjunto de cebadores y kit para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos.

La invención se refiere a un conjunto de cebadores, procedimiento y kit para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces asintomáticos, más concretamente a la aplicación de un procedimiento no destructivo ni cruento que comprende la combinación de RT-PCR, RT-PCR anidada, e hibridación en dot-blot; a los cebadores empleados en dicho procedimiento; y al kit que permite la realización de dicho procedimiento. La invención es de aplicación en el sector de la acuicultura, y más particularmente en el control del estado de salud de peces, tanto de poblaciones naturales como cultivadas.

La enfermedad de la necrosis pancreática infecciosa (IPN) es una patología vírica aguda, altamente contagiosa y de muy amplia distribución geográfica que afecta a peces cultivados y salvajes tanto de agua dulce como de ambientes marinos, así como a especies diádromas. Esta enfermedad, que puede cursar como brotes epizoóticos alcanzando alta tasa de morbilidad y mortalidad, ha sido descrita en los cinco continentes, siendo más frecuente en Europa, en el Lejano Oriente, y en América del Norte y Sur.

El agente causal de esta enfermedad se ha denominado IPNV, un virus perteneciente al género Aquabirnavirus, familia Birnaviridae. Este virus posee un virión icosaédrico desnudo con dos segmentos de ARN bicatenario como material genético. Las principales proteínas de la nucleocápside son la VP2 (proteína mayoritaria) y VP3 (proteína interna de la cápside).

IPNV causa infecciones clínicas en alevines y juveniles de peces salvajes y cultivados, y los supervivientes de la infección pueden convertirse en portadores asintomáticos del virus.

El método de análisis estándar recomendado por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) en 2003 se basa en los siguientes puntos:

1. Aislamiento del IPNV en cultivo celular a partir de los tejidos de peces enfermos. Identificación del IPNV aislado en cultivo celular, mediante neutralización con anticuerpos específicos o por inmunofluorescencia indirecta o por un enzimoinmunoensayo.

2. Detección directa del IPNV en tejidos de peces afectados por inmunofluorescencia indirecta, enzimoinmunoensayo, por coaglutinación o por inmunohistoquímica.

Los sistemas más efectivos de detección de microorganismos por métodos moleculares, que no requieren su cultivo, están basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La presente invención se refiere a un protocolo basado en técnicas de PCR para la detección del virus IPNV, así como los cebadores específicos para ello. Además, éste se combina con un protocolo de hibridación en dot-blot, utilizando una sonda de ADN bicatenario (ADNbc), para aumentar la sensibilidad de la técnica y como herramienta de confirmación de los productos de amplificación. Este método, al ser no destructivo, evitaría la consiguiente pérdida valiosa del cultivo de peces, como por ejemplo ejemplares reproductores.

Descripción de la invención

El problema técnico planteado es lograr un método rápido y fiable que permita la detección específica de IPNV en muestras de sangre de peces. El procedimiento no destructivo propuesto se basa en la aplicación de dos técnicas moleculares, una RT-PCR anidada y una hibridación dot-blot para la detección del IPNV a partir de sangre de peces portadores inaparentes del virus. Para la RT-PCR se han diseñado cebadores específicos que amplifican un fragmento de 599 pares de bases (pb) de la región del precursor de VP2 (proteína mayoritaria de la cápside vírica) dentro del gen vírico que codifica la poliproteína. Para la RT-PCR anidada se han diseñado cebadores internos que amplifican un fragmento de 191 pb. Mediante esta técnica hemos conseguido detectar IPNV en menos de un día de trabajo y sin necesidad de realizar cultivos celulares de las muestras. A partir de este producto de amplificación de 191 pb, se ha diseñado una sonda de ADNbc marcada con digoxigenina para hibridar en dot-blot los productos obtenidos mediante las reacciones de RT-PCR y RT-PCR anidada.

Etapas:

a. Extracción y purificación del ARN total de las muestras.

b. Amplificación mediante RT-PCR de una secuencia de 599 pb de la región del precursor de la proteína VP2 utilizando un conjunto de cebadores en el cual al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. Preferentemente, dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende SEQ ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende SEQ ID NO 2. Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a SEQ ID NO 1 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a SEQ ID NO 2.

c. Amplificación de un fragmento de 191 pb de los productos resultantes de la primera amplificación mediante RTPCR anidada utilizando un conjunto de cebadores en el cual al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO4. Preferentemente, dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende SEQ ID NO 3 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende SEQ ID NO 4. Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 3 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a la SEQ ID NO 4.

d. Obtención de sondas de ADN bicatenario a partir de los productos resultantes de la segunda amplificación (RTPCR anidada).

e. Hibridación en dot-blot de los productos resultantes de la segunda amplificación (RT-PCR anidada) usando las
sondas de ADN bicatenario obtenidas en la etapa (d).

f. Detección de los productos hibridados mediante inmunoensayo.

FUENTE | OEPM